甘利欣对体外诱导的酒精性脂肪肝细胞的影响

甘利欣对体外诱导的酒精性脂肪肝细胞的影响

脂肪肝(fatty1iver，FL)的发生与酗酒、肥胖、糖尿病、脂质代谢异常及一些药物使用有关。FL可分为两大类，酒精性脂肪肝病(a1coho1icfatty1iverdisease，AFLD)和非酒精性脂肪肝病(non—alcoho1icfattY1iverdisease，NAFLD)，其发病机制尚未充令阐明。近年来，随着我国经济的高速发展和人民牛活水平的提高，嗜酒者的增加，酒精性脂肪肝的发病率越来越高。并且是常见肝脏疾患，因其可逐渐发展为肝纤维化、肝硬化而危害极大。而与其他类型的脂肪肝相比，酒精性脂肪肝发生肝纤维化和肝硬化的进程相对较快，并可能进展到肝癌。因此，酒精性脂肪肝也越来越受到人们的重视i。J。当前对酒精性脂肪肝的研究主要采用是动物模型，存在较大的个体差异，并且实验条件不易控制、影响冈素多等不利因素-。本文采用低浓度的乙醇长时间作用于正常的肝细胞(L02株)，模拟酒精性脂肪肝的发病过程，并给予甘利欣处理，比较处理前后细胞周期的改变，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)以及Y一谷氨酰转肽酶(GGT)的泄露量，以观察其对酒精性脂肪肝的影响。

1 资料与方法

1．1正常肝细胞的培养人正常肝细胞株L02，由中山医科大学肝炎研究所赠送，用含10％H~牛血清(某生物工程材料有限公司)的1640(美国GIBCO公司)培养液传代培养。

1．2乙醇作用浓度的确定将处于对数生长期的L02细胞调整浓度为5×10一个／ml培养于96孔板中，分别加入不同浓度(3％，6％，12．5％，25％，50％)的乙醇，用MTT比色法测定细胞活力。结合细胞形态观察，选择亚致死堵作为诱导细胞形成脂肪肝的最佳浓度。

1．3酒精性脂肪肝细胞模型的建立将处r对数生长期的L02细胞分成两组，即：对照组和诱导组，调整细胞浓度，使每组细胞浓度均为5×10个／ml。对照组：刚常培养基培养；诱导组：每篷升正常培养基中添加乙醇3．125ul(记浓度为3％)培养。培养3d后，更换正常培养基=}l_}培养3d，并以6d为周期传代。待细胞内Ⅲ现泡后，制备标本做油红0染色。

1．4廿利欣作用浓度的确定细胞经诱导7个月～28代时仍生长良好，说明模型稳定，故选28代细胞为处理对象。将处于对数生长期的第28代细胞调整浓度为5×10个／m]培养j96孔板中，分别加入不同浓度(6．25、12．5、25、50、100ug／m1)的甘利欣，用MTT比色法测定细胞活力。结合细胞形态观察，选择亚致死量作为处理脂肪肝细胞的最佳浓度。

1．5甘利欣对酒精性脂肪肝细胞模型的影响将第28代细胞分组：继续诱导组、治疗组(脱离乙醇组、甘利欣组)，调整细胞浓度，使每组细胞浓度均为5×104个／ml。继续诱导组：即每毫升正常培养基中添加乙醇3．125ul：脱离乙醇组：即只用正常培养基培养；甘利欣组：脱离乙醇，并在正常培养基中加入浓度为25ug／m1甘利欣进行处理，每3d给1次药。以上各组均以6d为周期传代。处理5周后，流式细胞仪检测细胞周期改变，分别用ALT、AST、GGT试剂盒(某生物工程研究所。)检测以各组细胞的ALT、AST、GGT泄露量。此实验重复3次。

1、6统计学处理提供计量资料用(±S)表示，组问比较采用两样本的配对f检验，用sPSSlO．O软件进行数据处理。

2 结果

2、1乙醇作片j浓度的确定实验结果表明(表1)：随着乙醇浓度的显著增加，活细胞的数目逐渐减少，乙醇浓度为3％时活细胞数目减少最少，故选3％为诱导浓度。

2．2甘利欣作用浓度的确定实验结果表明(表2)：低浓度组对酒精性脂肪肝细胞的生长影响不大。当浓度大于5Oug／ml后，对酒精性脂肪肝细胞生长影响差别不显著，因此不选为作用浓度。与酒精性脂肪肝细胞组对比，浓度为25ug／m1组促细胞生长作用稍大，故选其为作用浓度。

2．3油红O染色L02细胞经亚致死量乙醇长期诱导后，油红O染色法示L02细胞内几乎都未着色(图1)，而乙醇诱导后细胞内则明显可见被染成桔红色的颗粒(图2)。

2．4细胞周期的变化实验结果表明(表3)：第28代细胞经甘利欣作用后，GO／G1期细胞数增多，G2／M期、S期细胞减少。提示细胞被阻滞在GO／G1期，细胞的增殖生长速度减缓。当酒精继续作用于第28代细胞时，细胞一方面表现为增殖速度减慢(但程度不如甘利欣组显著)，一方面开始出现凋亡。

2．5ALT、AST及GGT的泄露量ALT、AST的计算：505nm波长测定各管吸光度值(OD值)。测定管OD值减去对照管OD值，得绝对OD值，查标准曲线，求得相应的ALT、AST活力单位。GGT的计算：530nm波长，空白管调零，测定各管OD值。定义lOOml培养基和基质液在37~C作用15min释放出a一萘胺1umol为1个单位，按以下公式计算GGT的活力。GGT活力=测定管0D值一空白管0D值待测管0D值一空白管0D值×标准浓度(0．15umol／m1)×100ml实验结果表明(见表4)：经甘利欣处理后，脂肪变肝细胞ALT、AST及GGT的泄露量明显下降；随着乙醇的继续作用，细胞ALT、AST及GGT的泄露量则继续增加，尤以GGT的增加显著。

3 讨论

本实验通过用亚致死量的乙醇长期反复作用于人正常肝细胞L02，建立酒精性脂肪肝的体外细胞模型。油红O染色法主要用于显示中性脂肪(即甘油三酯)，甘油三酯被染成桔红色。此法的特点是：能将较小的脂肪滴显示出来，并且着色深。从实验结果可知，L02细胞经亚致死量的乙醇诱导后油红O染色呈阳性，加之传代到第28代仍生长良好，证明建模成功，且模型稳定。这与临床上，人少量长期反复饮酒后也会发生脂肪肝的病理过程基本一致。

乙醇引起酒精性脂肪肝的可能机理乙醇在肝脏代谢致使NADH／NAD的比例增加，抑制线粒体三羧酸循环，使肝内脂肪酸代谢紊乱，氧化减弱，从而产生肝细胞内甘油三酯沉积；脂肪酸B一氧化减弱，使游离脂肪酸增加；以及乙醇使胆碱需要量特异性增加，从而影响肝脏载脂蛋白的合成，进而影响肝内甘油三酯的清除，致使大量的甘油三酯在肝内蓄积而形成脂防肝[6_7]。在细胞水平实验中出现的细胞内甘油三酯积聚的现象，与动物水平的实验性脂肪肝基本一致，并且相对动物实验而言，细胞实验的影响因素少，可行性高。故我们可以认为，细胞水平的实验可以作为动物水平实验的补充，二者的有机结合，将为进一步研究酒精性脂肪肝的发病机制以及临床治疗药物的筛选提供有效的途径。

甘利欣主要成分为甘草酸二铵，其具有较高的亲脂性，易与体内受体蛋白及类固醇激素靶细胞结合，产生内源性糖皮质激素样作用，因而具有较强的抗炎、稳定细胞膜、保护肝细胞的作用;此外，甘利欣不但能抑制I、III型前胶原mRNA的合成达到抗纤维化的目的，还能抑制CYP2E1的活性，减少有毒物质的产生，从而抑制氧自由基和炎性因子的产生，减轻肝功能损害[1o-11]。实验中我们发现，经甘利欣的作用后，脂肪变肝细胞的细胞周期发生改变：细胞大部分阻滞在GO／G1期，使细胞的增殖生长速度减缓，从而在一定程度上阻止了脂肪肝的进一步发展。在临床上，除血清ALT、AST增高外，酒精性肝病患者还常有GGT显著增高。实验结果显示：与继续诱导组相比，甘利欣组ALT、AST的泄露量明显降低，且GGT量降低两组比较差异有统计学意义(尸<0．05)，说明甘利欣可以减轻乙醇对肝细胞膜的损害，从而改善肝功能，延缓或阻止脂肪肝向肝纤维化和肝硬化进展。与继续诱导组相比，脱离乙醇组各项指标也有一定