H2株甲肝减毒活疫苗安全性及免疫效果

甲型肝炎(HepatitisA)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的一种自限性病毒性传染病，我国是甲型肝炎的高流行区。且低屏障区与高屏障区交互存在，疫苗免疫是预防和控制该病流行最有效的措施。1988年中国医学科学院医学生物学研究所(以下简称生物所)开始对甲肝活疫苗(H2株)进行实验性研究，并于1992年取得试生产文号，至今约有8千万人进行了预防接种，证明具有良好的安全性、免疫原性和保护性C3-53。但由于H2株HAV在细胞内增殖周期长、产毒量偏低等特征，制约了疫苗产量和质量。为此，生物所摸索采用悬浮吸附方法生产甲肝活疫苗并取得良好结果。本文报道了悬浮吸附工艺甲肝活疫苗接种恒河猴的试验结果。

1材料与方法：

1．1疫苗：

1．1．1单层吸附工艺疫苗按文献和<中国生物制品规程)2000版[7)中所述方法进行疫苗制备。

1．1．2悬浮吸附工艺疫苗按国家发明专利(专利号：ZL941012573)和<中国生物制品规程)2000版方法进行疫苗制备。

1．2动物抗一HAV阴性，丙氨酸转胺酶(ALT)正常的健康恒河猴，体重2．0～4．Okg，每个样品各接种5只。由生物所灵长类研究中心提供。

1．3方法：

1．3．1接种下肢静脉注射，1．0ml／只，疫苗滴度及生产情况见表1。接种疫苗后3d内，每天观察注射部位有无红肿、硬块及精神、食欲等异常现象。1．3．2丙氨酸转胺酶(ALT)测定血清分离后于24h内进行ALT检测。试剂购自上海长征一康仁医学有限公司，操作按说明书。采用F一33半自动生化分析仪测定。1．3．3血清抗一HAV检测接种疫苗前及接种后2，3，4，6，8周采血后立即分离血清，保存于一20℃以下，待观察结束所有血清样品用生物所生产的甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒检测血清中HAV抗体。操作按说明书。用BIO-RAD450型酶标仪。波长492nm测定A值。

1．3．4疫苗感染性滴度测定疫苗病毒液和接种疫苗作10倍系列稀释，选若干适当稀释度，1ml／瓶接种于KMBl7单层细胞(40cm2)各4瓶。37℃吸附2h后补充适量维持液，35℃培养26d。收获细胞经反复超声波处理后，用生物所生产的甲型肝炎病毒抗体IgM诊断试剂盒检测HAV。用BIO—RAD450型酶标仪。波长492nm测定A值。按Reed—Muench法计算滴度。

1．3．5肝脏组织取样接种疫苗前及接种后4、8周做肝脏穿刺，观察到期处死动物，取肝组织块，用Boin氏液固定，常规石蜡切片，HE染色。普通光学显微镜检查。

1．3．6病变分级按Krawczynski(S31981年肝脏病变分度标准判定。
2结果：

2．1安全性及免疫效果：

2．1．1安全性(1)免后猴体反应观察：接种疫苗后3d内，所有恒河猴注射部位均无红肿、硬结等局部反应，亦未见发热、厌食、活动异常等全身反应。观察全程未见与肝炎有关的副反应。(2)ALT检测：接种疫苗后2～8周ALT除983+984和992分别有一只猴于2，3，4周有一过性升高外，其余猴各检测周次ALT无异常。

2．1．2免疫效果免疫后4周，15只猴抗一HAV全部阳转，983+984、992和993+994的抗体几何平均滴度分别为9．2，14．9和27．9；8周观察到期时抗体几何平均滴度分别达到32，64和64。992和993+994疫苗接种恒河猴产生的抗一HAV几何平均滴度差异无统计学意义(P>0．05)，两者均明显高于983+984疫苗(P<0．01)。

2．2肝脏组织病理学除993+994疫苗接种的370号猴0周，4周及8周汇管区有少量淋巴细胞浸润(+／一)，其余14只猴0，4周肝脏组织病检均无组织病理学改变。8周时983+984两只猴(353和354号)、992两只猴(362和366号)、993+994两只猴(368和371号)肝脏汇管区有少量淋巴细胞浸润(+／一)。15只猴观察到期处死尸检均未见甲肝病变。

3讨论：

H2株甲肝活疫苗病毒培养周期一般为28d，文献对悬浮和单层吸附方法增殖H2株HAV进行了病毒繁殖动力学试验，证明H2株HAV采用悬浮吸附方法增殖，培养20d滴度即达高峰，且感染性滴度可维持4--6d，而采用单层吸附方法培养24d才达高峰，感染性滴度维持2d即下降。根据上述结果，本研究对单层和悬浮工艺不同收毒时间疫苗进行了恒河猴免疫接种观察，以期为悬浮吸附工艺最佳收毒时间提供动物免疫方面的实验依据。

本观察用单层吸附工艺26d收毒疫苗和悬浮吸附工艺23和26d收毒疫苗对15只恒河猴进行了免疫，免后无接种部位及全身异常反应，血清肝酶无异常升高，除1只猴免前、4，8周肝组织病检(+／一)，其余肝组织在观察全程无病理改变，尸检均未见甲肝病变，与H2M20K5猴体免疫接种的反应一致。说明2种不同工艺疫苗均有良好的安全性。罗其胜等(hi曾做过72只狨猴的肝穿活检，认为(+／一)病变可能是由于动物本身或经常接受肝穿所致。本观察中370号猴免前即有少量淋巴细胞浸润(+／一)，免后4，8周汇管区也出现少量淋巴细胞浸润(+／一)，这可能是由于动物本身的原因和反复肝穿所造成。免后4周，抗一HAV全部阳转，8周时悬浮吸附工艺23和26d收毒疫苗猴体免疫效果一致，且两者均明显优于单层吸附工艺疫苗，这一结果提示，悬浮吸附工艺23d和26d病毒培养的H2株甲肝活疫苗均具有良好的免疫原性。

本次试验结果表明，悬浮吸附工艺培养H2株HAV23d收获病毒介于病毒培养感染性滴度高峰起始期与下降期中间。能尽可能排除病毒培养过程中不定因素对疫苗产量及质量稳定性带来的影响，且具有良好的免疫原性，是悬浮吸附工艺培养H2株HAV较为稳妥的收毒时间。