草莓携带甲肝病毒ELISA检测方法

甲型肝炎(hepatitisA)是世界上主要流行的急性传染性肝炎，是由小核糖核酸病毒科(picofnaviridae)嗜肝病毒属(hepatovirus)的甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus，HAV)弓l起，是引起食源性疾病的主要病毒m刽。研究表明，被污染的食物通常包括甲壳类动物、水果和蔬菜，由于污染的水源流经其生长地区或接触了带有病毒的粪便肥料或物品，或是经过携带甲肝病毒的食品加工人员，都有可能造成相关动物及植物甲肝病毒污染，人类的HAV感染主要是经过粪-口传播。

鉴于酶联免疫检测方法(enzYme一1inkedimmunosorbentassay，ELISA)特异性强，操作便捷，成本低的特点，可作为大量样品的初步检测方法，也是目前检测食源性病毒的主要应用的方法之一，但是，其应用范围大多局限于临床样本的检测。近年来，草莓作为传带人类甲型肝炎病毒的载体已经引起国内外科技工作者的广泛关注。本实验拟对通过甲肝病毒抗体的酶标记和ELISA检测方法的研究，建立适宜的甲肝病毒ELISA检测方法，并应用于人工草莓样品及相关果蔬样品中甲肝病毒的检测，其灵敏度、特异性和操作便利方面有望满足食品安全检测的要求。同时，也为进一步将该方法与微流控芯片系统结合奠定基础。
用辣根过氧化物酶通过戊二醛法标记甲肝病毒单克隆抗体，建立了甲肝病毒双抗体夹心ELISA(DAS．ELISA)检测方法。在ELISA反应中酶标抗体的工作浓度为1：100稀释，对甲肝病毒的检测灵敏度为2μg/ml。在草莓汁液中添加灭活的甲肝病毒，该ELISA的检测下限被推荐为4μg／ml。甲肝病毒ELISA方法便捷、可靠，适用于草莓上携带甲肝病毒的检测。

讨论：

本研究中自行进行了甲肝抗体HRP标记，通过对包被抗体和HRP酶标抗体的筛选，建立了双抗夹心ELISA检测HAV的方法，确定了对HAV的检测灵敏度和在草莓汁液中的检测下限值。

酶标记抗体的制备是建立ELlSA检测抗体技术的重要环节，其活性的高低直接关系到免疫酶反应的成功与否。酶标记抗体的质量主要取决于抗体的纯度、活性及酶与抗体的亲和力，其次要有良好的制备方法。本研究采用戊二醛法进行交联，生物学检测结果显示酶标抗体具有活性，但效价较低，工作使用浓度也相对较高，这是否与抗体和HRP的结合比有关，如抗体量和HRP的比例，这方面还有待进一步研究。实验同时比较了双抗夹心ELISA和间接ELISA的检测灵敏度，结果显示双抗夹心法较间接法灵敏度高，符合一般性的ELISA反应。

在本研究中，从ODdODN值来判定检测结果(阳性和阴性)来看，甲肝病毒在PBS和草莓汁液中的ELlSA检测下限值均可为2I．tg／ml，但是从迸一步的比值大小分析，前者为2．9(ODP／ODN=0．23／0．08)，后者为2．3(ODdODN=O．14／0．06)，显示草莓提取液对ELISA反应有一定的抑制作用。另据文献报道，植物中被氧化的多酚，可能抑制ELISA反应，从而加深ELISA反应的背景，本研究结果与报道的ELISA检测反应类似。根据最近的RT．PCR法检测甲肝病毒的研究中关于草莓前处理方法的报道推测，如果采用涂抹洗涤法提取草莓表面HAV而不破坏抗原的方法，则不会产生酚类物质，从而降低或去除对ELISA反应的干扰，提高病毒的回收率和检测灵敏度，这方面也有待进一步研究。

目前在国际上普遍使用的检测食品中HAV的方法为RT-PCR法，虽然此方法特异性强、灵敏度高，但是PCR法成本较高，易出现假阳性，而且食品种类各异，且成分复杂，会产生许多RT．PCR抑制因子，如何在提高病毒富集方法的同时除去这些抑制物质是目前尚未解决的两个问题。本研究所建立的夹心ELISA方法操作简便、成本较低且样品处理要求低，适用于大量食品样品中甲肝病毒的初步筛查，有较好的实用价值。该研究亦为进一步应用微流控芯片免疫法检测食品中携带的甲肝病毒奠定了基础。